1背景介绍
哮喘又名支气管哮喘，是一种由复杂细胞组分及因子共同参与的常见多发性疾病。哮喘的特征是气道的慢性变应性炎症，其主要特征是气道发炎，呼吸系统阻力增加等，在其发病因素中最重要的外因是变应原，尘螨是引起哮喘发病的主要变应原之一，因此复制尘螨模型在哮喘的研究中非常重要。目前国内多采用屋尘螨提取液，其成分较为复杂，很难复制出天然的尘螨致过敏性哮喘模型，因此本研究采用ALK公司的屋尘螨变应原制剂对动物进行多次腹腔注射致敏以及雾化激发进行造模，该屋尘螨变应原制剂是大分子量蛋白的混合物，吸附在氢氧化铝上，从而达到缓慢释放，长久刺激动物的呼吸系统。本研究以幼龄SD大鼠为研究对象，建立屋尘螨诱发的幼龄大鼠哮喘模型，对模型的肺功能和病理改变等主要指标进行检测，并采用硫酸特布他林片考察模型的适用性，为哮喘治疗药物开发提供合适的模型工具。
2 材料和方法
2.1实验动物
48只SPF级SD大鼠，3周龄，雌雄各半，体质量50~80 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
2.2主要试剂和仪器
（1）主要试剂：屋尘螨变应原制剂；IgE、His ELISA试剂盒。
（2）主要仪器：超声雾化器；酶标分析仪；振荡式肺功能检测系统；生物显微镜。
2.3试验方法
（1）分组：将幼龄大鼠按照体质量和性别随机分为阴性对照组、模型对照组、阳性对照组（予硫酸特布他林片），每组8只动物，雌雄各半。
（2）造模：阴性对照组以PBS溶液致敏和激发，其余各组大鼠均于分组后腹腔注射屋尘螨变应原制剂（1000 SQ-U/mL,0.1 mL/只），每天注射1次，连续3 d，末次致敏后间隔14 d进行激发，激发方法：动物置于雾化装置中，每天不间断雾化吸入屋尘螨变应原制剂（2000 SQ-U/mL)5 min，连续雾化激发7 d。
（3）给药：按体表面积等效剂量法折算，设定阳性对照组（硫酸特布他林片）的给药剂量为0.72 mg/kg，前4 d给予等体积的纯水，后3d给予硫酸特布他林药液。
（4）检测指标：①各组大鼠均于末次激发后，采用1.5%戊巴比妥钠注射液尾静脉注射麻醉，然后行颈部正中气管切开并插管，测定呼吸系统阻力（Rrs）、呼吸系统顺应性（Crs）及呼吸系统弹性（Ers）。②测定结束后采用腹主动脉采血法将动物安乐死，取全血测定白细胞总数。③剩余血液不抗凝，分离血清，用于IgE、His表达水平的测定。④剖取动物肺脏称取质量计算肺脏系数。⑤将各组动物肺脏组织用10%甲醛固定，经脱水、石蜡包埋，切片，常规HE染色后，光镜下观察各组动物的肺脏组织病理学变化。
3试验结果
3.1 肺功能
与阴性对照组相比，模型对照组动物Rrs、Ers均显著升高，Crs显著降低；与模型对照组相比，阳性对照组动物Rrs、Ers均显著降低，Crs显著升高。见表1。
表1 大鼠肺功能指标检测结果

组别	n	Rrs(cmH2O·s/mL)	Crs (mL/cmH2O)	Ers (cmH2O/mL)
阴性对照组	8	0.1126±0.0020	0.7715±0.0269	1.3790±0.0506
模型对照组	8	0.1363±0.00524△	0.5554±0.03094△△△	1.7912±0.0778 △△△
阳性对照组	8	0.1104±0.0022 ∗	0.6927±0.0221 ∗	1.5026±0.0325∗∗

注：与阴性对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；与模型对照组比较，∗P<0.05，∗∗P<0.01，下同。
3.2 肺脏系数
与阴性对照组相比，模型对照组动物肺脏系数显著升高。与模型对照组相比，阳性对照组动物肺脏系数显著降低，见表2。
表2 大鼠肺脏系数统计结果

组别	n	体质量(g)	肺脏质量（g)	肺脏系数（%）
阴性对照组	8	287.00±22.00	1.39±0.08	0.48±0.01
模型对照组	8	286.00±21.00	1.57±0.09	0.55±0.02△
阳性对照组	8	304.00±23.00	1.44±0.08	0.48±0.02∗

3.3 白细胞总数
与阴性对照组相比，模型对照组动物白细胞总数显著增多。与模型对照组相比，阳性对照组动物白细胞总数未见明显差异，见表3。
表3 大鼠血液中白细胞总数统计结果

组别	n	白细胞总数 (×10^9/L)
阴性对照组	8	2.80±0.34
模型对照组	8	6.22±0.5544
阳性对照组	8	5.15±0.79

3.4 血清lgE及His表达水平
与阴性对照组相比，模型对照组动物血清中IgE、His表达水平均显著升高。与模型对照组相比，阳性对照组IgE、His表达水平均无显著差异，见表4。
表4 大鼠血清中IgE及His表达水平

组别	n	IgE(μg/mL)	His(ng/mL)
阴性对照组	8	22.02±0.85	11.67±0.16
模型对照组	8	25.02±0.4944△△	12.54±0.2244△△
阳性对照组	8	23.93±0.68	12.12±0.22

3.5 各组大鼠肺组织病理学检查结果
阴性对照组动物肺脏各级管腔结构正常，肺泡腔无扩张或缩小，间质支气管/血管无疏松或狭窄，亦未见炎细胞浸润，见图1。模型对照组动物肺脏气道壁皱缩、血管周围疏松/水肿、支气管/血管间质炎细胞（以中性粒细胞和嗜酸性粒细胞为主）浸润，而阳性对照组动物上述病变均有不同程度的减轻。 4试验结论与讨论
本研究采用吸附于氢氧化铝上的屋尘螨变应原制剂对4周龄大鼠进行腹腔注射致敏，间隔2周后进行雾化激发，该诱喘剂致敏、激发后在幼龄动物体内缓慢释放，不断刺激动物发育阶段的呼吸系统，较好地模拟出临床上儿童因长期处于粉尘环境中而导致的过敏性哮喘疾病。本试验结合哮喘的发病机制，采用屋尘螨对动物进行致敏和激发造模。模型建立成功后主要从肺功能、免疫应答、炎症、肺水肿、肺组织病理学等几个方面考察硫酸特布他林片对幼龄动物哮喘的改善作用。首先采用振荡式肺功能检测系统测定大鼠的肺功能指标，结果显示模型对照组动物呼吸系统阻力及弹性均显著升高，顺应性显著降低，表明模型动物已具有明显的呼吸功能障碍。病理学检查发现模型对照组动物表现出明显的气道壁皱缩，血管周围疏松/水肿。推断上述病理变化为导致模型动物呼吸系统阻力及弹性升高、顺应性下降的主观因素，而硫酸特布他林片在0.72 mg/kg剂量下对动物呼吸系统阻力及弹性的降低均有不同程度的逆转作用，进而导致动物的顺应性升高。综合病理学结果表明，硫酸特布他林片可以很好地缓解幼龄哮喘动物的气道壁皱缩，血管周围疏松/水肿，改善幼龄哮喘动物的呼吸功能。本研究采用阳性药硫酸特布他林片评估所建立的哮喘动物模型的稳定性，可用于药效学评价研究。