1 背景介绍
特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种自身免疫相关的慢性瘙痒炎症性皮肤病，可伴随疼痛、红斑状丘疹、干皮症、湿疹等症状和临床表现。AD在成人中发病率为10%，而在发达地区儿童的患病率更是高达20%；而半数以上的患者最终会发展为其他特应性疾病，如哮喘、过敏性鼻炎等。目前AD尚无治愈手段，临床以外用药为主，包括糖皮质激素、钙调神经磷酸酶抑制剂、抗组胺药等治疗用药，以及抗生素、抗菌药等对症抗感染用药；近年来，Janus激酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂-4抑制剂、生物制品表现出较好的潜力。理想的动物模型是AD病理机制研究和药物药效评价的良好载体。常用的AD动物模型有转基因小鼠模型（如白介素4转基因小鼠）、自发小鼠模型（如Nc/Nga小鼠）、半抗原（卵清蛋白、2,4-二硝基脲苯、2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene, DNCB)等）诱发的小鼠模型。Brown-Norway（BN）大鼠为近交系大鼠，具有较高的致敏性，近年来常被用于过敏、哮喘等免疫性疾病研究。应用大鼠模型考察经皮制剂的抗皮炎药效作用，在给药准确性、操作方面优于小鼠模型。本研究以BN大鼠为研究对象，建立DNCB诱发的AD模型，对模型的表观指征、因子和病理改变等进行检测，并采用他克莫司软膏考察模型的适用性，为AD治疗药物开发提供合适的模型工具。
2 材料和方法
2.1 实验动物
SPF级BN大鼠共20只，雌性，8~10周龄，体重130~160 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
2.2 主要试剂和仪器
（1）主要试剂：0.1%他克莫司软膏(Astellas Pharma Inc. ,批号057040)；2,4-二硝基氯苯(DNCB,西亚化学科技(山东)有限公司,批号WJ6J6)；丙酮(广州化学试剂厂，批号2021020109；橄榄油(佳格投资(中国)有限公司，批号2021BZ20191212);异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批号21022101)；IgEELISA 试剂盒( Reagent Genie Ireland Ltd. , 批号R1074G064)；肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)(北京雷根生物技术有限公司，批号0607A21)。
（2）主要仪器：电子天平(赛多利斯科学仪器(北京) 有限公司)；螺旋测微仪(三丰精密量仪(上海)有限公司)；VMR 型麻醉机(Midmark Corporation)；酶标分析仪(BioTek Instruments, Inc. )；生物显微镜( LeicaBiosystems)。
2.3 试验方法
（1）分组与造模：将BN大鼠按体重随机分为3组，分别为对照组、模型组、他克莫司组。对照组4例动物，模型组和他克莫司组8例动物。分组当天记为D0。模型组和他克莫司组动物于D1、D3、D7、D9、D12、D14、D16、D19、D21、D23和D25，双耳均匀涂抹0.5%DNCB溶液(丙酮∶橄榄油=3∶1) 40μL；对照组动物双耳均匀涂抹丙酮-橄榄油溶剂40μL，造模期间大鼠佩戴伊丽莎白圈。
（2）给药：首次造模当天开始，对他克莫司组动物右耳经皮涂抹他克莫司软膏每耳30 mg，每天1次，连续给药25 d。给药6 h后以生理盐水轻轻拭擦除去药物。每天给药后至除药前，大鼠佩戴伊丽莎白圈。对照组和模型组大鼠双耳、他克莫司组左耳不做处理。
（3）耳部炎症症状评分：每次造模约6 h后，对造模耳进行炎症症状评分。评分由干燥/脱屑，出血/红疹，溃烂/表皮脱落，水肿症状综合评定。每个症状评分标准如下：无症状计0分，轻度（症状存在，需仔细辨别观察方可看到）计1分，中度（症状可立即看到）计2分，重度（症状非常明显）计3分。最终评分为4种症状评分之和，总分值为0~12分。
（4）耳厚度、耳重量测量：首次造模前、每次造模约6 h后，测量耳厚度；末次造模次日，对动物实施异氟烷吸入麻醉后腹主动脉放血安乐死，裁取对照组双耳、模型组和他克莫司组右耳近似部位约8 mm大小的圆片，进行称重。
（5）耳组织病理学检查：取部分耳圆片组织置于10%福尔马林中固定，经常规脱水、石蜡包埋、切片后，常规苏木素-伊红染色和甲苯胺蓝染色后，光学显微镜下观察皮肤组织增厚、基底细胞变性坏死、炎细胞和肥大细胞浸润等病理改变。病理改变程度根据下述级别进行判定：

评价程度	视野情况
正常	未观察到组织学改变或组织结构基本正常
轻微	病理损伤范围零星可见，不构成区域性
轻度	灶性、多灶性或散在分布的损伤，这些损伤范围在100倍镜下可见1/3~1个视野
中度	损伤在组织中占主导性地位，灶性、多灶性或散在分布的损伤，这些损伤范围在100倍镜下可见1~3个视野
重度	损伤在组织中占绝对优势，灶性、多灶性或散在分布的损伤，这些损伤范围在100倍镜下可见3个视野以上

3 试验结果
3.1 大鼠耳部炎症症状观察和评分
造模12 d后，模型组大鼠右耳和左耳耳部皮肤出现红肿、脱屑、出血等炎症症状，症状评分值显著提高，16 d分值达到最高，直至25 d均维持在高水平，见图1。给药12 ~25 d，与模型组相比，他克莫司组大鼠给药右耳耳部炎症症状评分值显著降低，非给药左耳耳部炎症症状评分值亦明显降低。 图1  DNCB诱导大鼠耳组织炎症反应评分（n=8）
注：A：造模第25天耳部图；B：大鼠右耳组织炎症评分；C：大鼠左耳组织炎症评分。
3.2 大鼠耳厚度和耳重量变化
与对照组相比，造模1 d开始，模型组动物左耳和右耳逐渐增厚；造模9 ~25 d，模型组大鼠左耳和右耳呈显著性增厚，见图2。给药9~25 d，他克莫司组大鼠给药右耳增厚程度明显低于模型组右耳，非给药左耳增厚程度呈现低于模型组左耳的作用及趋势。
与对照组相比，模型组大鼠左耳和右耳片重量均明显增加；与模型组相比，他克莫司组大鼠给药右耳重量显著减小，非给药左耳重量亦显著减小，见表1。 图2  DNCB诱导大鼠耳组织增厚（n=8）
注：A：大鼠右耳组织增厚图；B：大鼠左耳组织增厚图。
表1 大鼠耳重量变化（n=8）

组别	给药右耳重量（g）	非给药左耳重量（g）
对照组	0.0275±0.0027	/
模型组	0.0350±0.0063*	0.0336±0.0058*
他克莫司组	0.0261±0.0018##	0.0276±0.0034#

3.3 大鼠耳部组织病理学改变
组织病理学结果见图3和表2。对照组耳部皮肤各层结构清晰完整，表皮无增厚，真皮层散在性个别肥大细胞（箭头指示）；模型组右耳组织皮肤角化过度和/或不全、颗粒层增厚、基底细胞变性坏死、细胞内水肿，伴随真皮层大量的炎细胞浸润，肥大细胞明显浸润；他克莫司组右耳皮肤各层结构完整，表皮无增厚，真皮层散在性个别肥大细胞。 表2 大鼠耳部皮肤病理学改变（n=8）

组别	病变   程度	表皮增厚	基底细胞变性坏死	炎细胞浸润	肥大细胞浸润
对照组	-	8	8	8	0
	±	0	0	0	8
	+	0	0	0	0
	++	0	0	0	0
	+++	0	0	0	0
模型组	-	0	0	0	0
	±	0	0	0	1
	+	4	1	2	7
	++	4	7	6	0
	+++	0	0	0	0
他克莫司组	-	8	8	8	0
	±	0	0	0	8
	+	0	0	0	0
	++	0	0	0	0
	+++	0	0	0	0

注：-、±、+、++、+++分别表示正常、轻微、轻度、中度和重度。
4 试验结论与讨论
本研究在造模期间，通过对皮肤炎症症状进行评分，并且测量耳部相近部位的厚度，综合评估模型的发展；于末期时，通过耳肿胀和组织病理学检查，评估模型的病变程度。模型组大鼠耳部皮肤自造模12d起出现明显的干燥、脱屑、红疹、溃烂、水肿等炎性反应，造模16d时，炎性反应达到峰值。模型组大鼠造模耳于造模后9d起明显增厚，于造模后16d厚度达到最大。模型组大鼠耳组织炎性反应和耳厚度在造模16~25d均维持在高水平。末期，模型组耳肿胀明显，耳部组织皮肤出现表皮增厚、基底细胞变性坏死、细胞内水肿，伴随真皮层大量的炎细胞浸润等AD样病理学改变。最终结果显示DNCB能诱导BN大鼠出现AD样反应。他克莫司软膏临床应用于成人及儿童AD，均有较明显的疗效，本研究采用阳性药他克莫司软膏评估所建立的AD模型的稳定性，可用于药效学评价研究，尤其是经皮给药制剂。
本模型在建模和药物评价中具有以下优势：改善动物的整体情况，能减少动物出现非造模直接因素，如垫料粉尘导致的皮肤损伤感染，降低动物的疼痛级别，满足3R原则中的“优化”原则；采用大鼠模型考察经皮给药制剂药效作用时，直接对造模耳给药，不仅避免毛发的干扰，而且给药后短时间内能使用伊丽莎白圈辅助防止大鼠抓挠给药部位，均能保证给药剂量的相对准确性。
注：DNCB为常用的化学半抗原性致敏原，常被用于制备免疫性模型。对于AD模型，众多研究采用的是经小鼠背部涂抹DNCB致敏后再于耳部涂抹DNCB激发，经皮给药部位为致敏背部，实际操作中会存在以下问题：（1）毛发是小动物皮肤疾病模型建立和炎症评分的障碍，尤其对于慢性皮肤疾病模型，目前的脱毛剂如脱毛膏、硫化钠溶液等脱毛效果不佳且维持时间短；（2）背部皮肤致敏导致破损后，容易受到饲养微环境的影响，需考虑采用玉米芯等少尘少屑的垫料，尽量减少环境对皮肤炎症反应的影响；（3）皮肤疾病药物多采用局部给药途径，毛发影响了药量准确性。基于上述问题，本研究以DNCB为诱导剂，考察对BN大鼠耳部涂抹刺激诱导产生皮肤AD样反应的可行性。