前言
     含有相同药物活性成份的两种制剂，若在相同摩尔剂量给后的生物利用度（药物吸收速度和吸收程度）落在可接受的预定限度内，则被认为具有生物等效性。生物等效性分类（BCS）是一种根据溶解性和渗透性对药物进行分类的方法，分为4个类别，即Ⅰ类（高溶解性，高渗透性）、Ⅱ类（低溶解性，高渗透性）、Ⅲ类（高溶解性，低渗透性）、Ⅳ类（低溶解性，低渗透性）。基于BCS的基本理论，药物活性成分（API）与药物制剂的溶出特征和辅料组成，二者一同构成控制普通口服制剂API吸收率和吸收程度的主要因素。
 
1. 基于BCS分类豁免生物等效性的发展
FDA于2000年发布指导原则，允许BCS Ⅰ类API的普通口服固体制剂在特定的溶出特征和辅料组成条件下豁免生物等效性研究，是首个应用BCS的生物等效性豁免的监管机构。NMPA于2016年发布了《人体生物等效性豁免指导原则》，适用于仿制药质量和疗效一致性评价中普通口服制剂基于BCS申请生物等效豁免，并于2018年多次单独发布可豁免或简化人体生物等效性试验品种目录。2019年ICH指导原则《M9：基于生物药剂学分类系统的生物等效性豁免》进入Step 4采纳阶段，目前在实施阶段。我国国家药监局药审中心于2021年12月发布第61号公告《关于实施国际人用药品注册技术协调会指导原则M9及问答有关事项的通知》，标志着我国基于BCS分类系统生物等效性豁免全面执行ICH M9指导原则。
2. Caco-2细胞在基于BCS分类豁免生物等效性中的应用
Caco-2细胞模型是一种人克隆结肠腺癌细胞，其结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系，可以用来进行模拟体内肠转运的实验。ICH M9指导原则指出，评价渗透性应优先基于人体药代动力学研究得出的吸收程度，例如绝对生物利用度或物质平衡。若绝对生物利用度³85%，则认为具有高渗透性。若³85%的给药剂量在尿中以原形药物，或以原形药物、Ⅰ相氧化和Ⅱ相结合代谢产物的总回收率，也认为具有高渗透性。基于BCS分类豁免生物等效性可接受已发表文献中的人体数据，但需包含必要的试验细节，否则无法判断研究结果的质量。还可使用经验证和标准化的Caco-2细胞体外方法评价渗透性，但Caco-2细胞测定结果应基于已获得的人体药代动力学数据进行评价。若通过体外细胞模型推断为高渗透性，还需证明渗透性不依赖于主动转运。 图1 Transwell培养板建立Caco-2细胞模型
3. Caco-2细胞渗透性测定方法的相关考虑
方法学验证
应使用零、低（<50%）、中（50-84%）和高（³85%）渗透模型药物，建立实验渗透率与人体药物吸收程度之间的排序相关性，以证明Caco-2细胞测定方法用于BCS渗透性测定的适用性。应通过在试验前后比较跨上皮电阻（TEER）测量值和或其他合适指标，确认Caco-2细胞单层的完整性。还应通过已证实的零渗透性化合物证明细胞单层的完整性（参见表1）。
表1 用于渗透性测定方法验证模型药物示例

分组	药物
高渗透性 （fa³85%）	安替比林、***、酮洛芬、萘普生、茶碱、美托洛尔、普萘洛尔、卡马西平、苯妥英、丙吡胺、米诺地尔
中渗透性 （fa =50-84%）	氯苯那敏、肌酐、特布他林、氢氯噻嗪、依那普利、呋塞米、二甲双胍、阿米洛利、阿替洛尔、雷尼替丁
中渗透性 （fa <50%）	法莫替丁、纳多洛尔、舒必利、赖诺普利、阿昔洛韦、膦甲酸、甘露醇、氯噻嗪、聚乙二醇400、依那普利拉
零渗透性	FITC-右旋糖酐、聚乙二醇4000、荧光黄、菊粉、乳果糖
外排底物	***、紫杉醇、奎尼丁、长春碱

 
测定相关考虑
试验中应证明试验化合物为被动转运，可以使用表达已知外排转运体的适当测定系统来验证。对于所选药物浓度，基底侧至顶端和顶端侧至基底侧方向的表观渗透性（Papp）比值<2证明是被动转运。
试验中还需证明渗透性验证中使用的试验药物浓度的合理性。在试验所处供试液中加入中渗透性和高渗透性药物作为内标，以证明方法的适用性和准确性。此外，应在试验结束时评价药物和内标的平均回收率，回收率需≥80%。若试验药物渗透性数值≥所选高渗透性内标，则认为该试验药物具有高渗透性。
4. 案例分享
Caco-2细胞培养
取出冻存的Caco-2细胞，迅速放入37℃水浴中，轻微震荡使冻存细胞融化。将冻存管中细胞液转至含已预热完全培养液的离心管，1000rpm离心5 min，移去上清液，加入5～6mL完全培养液，吹打分散细胞，转至细胞瓶中，用Caco-2细胞完全培养基，37℃ 5% CO₂条件下培养。收集处于对数生长期的Caco-2细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞后，加入适量细胞消化液消化细胞，待细胞从培养瓶底稍微脱落时转移至离心管，1000rpm离心5min，离心后移去上清液，加入适量完全培养基，细胞计数后，调整细胞密度为2×10⁵个，于transwell滤膜的顶侧（AP）加入细胞悬液200μL，基底侧（BL）加入无细胞培养基1mL，37℃ 5% CO₂条件下培养。每隔约24～48h换液一次，换液时观察细胞生长情况，细胞培养后定期进行电阻测量。 图2 Caco-2细胞模型
渗透性试验设计
渗透性实验分为试验组（A）和被动转运考察组（B），每组均设3个复孔（另设一空白孔用于电阻值计算），受试物溶液中加入低（纳多洛尔）、中（阿替洛尔）、高（普萘洛尔）渗透性药物作为内标。
渗透试验质量控制试验
待形成致密单层细胞时，用电阻仪测定细胞跨膜电阻值，计算单层细胞膜的跨膜表观电阻值，当TEER > 200 Ω·cm²时表明试验前测试系统合格。试验结束后吸去板内缓冲液，AP端加入零渗透性内标（萤光黄）共孵育，测试系统是否合格。
结果分析
建立药物与Caco-2细胞孵育体系，各培养天数TEER值结果见图4，渗透试验前质量控制试验中TEER值均大于200Ω·cm²，表明用于本试验的Caco-2细胞单层细胞膜完整性好。内标对照药的表观渗透系数、回收率结果见表2，低渗透性化合物-纳多洛尔、中渗透性化合物-阿替洛尔和高渗透性化合物-普萘洛尔的表观渗透系数、回收率及渗透试验后质量控制试验结果均符合接受标准，表明测试系统正常工作，建立的Caco-2细胞孵育体系合格，可用于受试药的Caco-2细胞渗透性试验探索研究。 图3 各培养天数-TEER值折线图
 
表2 内标药物表观渗透系数和回收率

内标对照药	表观渗透系数 PappAP-BL (10-6cm/s)	回收率（%）
普萘洛尔	23	93
阿替洛尔	2.5	100
纳多洛尔	0.68	97
荧光黄	0.00	/

注：1.当测试物的P_appAP-BL >10.0×10^-6 cm/s 时为高渗透性化合物；1.00×10^-6 cm/s< P_appAP-BL≤ 10.0×10^-6 cm/s时为中渗透性化合物；P_appAP-BL≤1.00×10^-6 cm/s时为低渗透性化合物；2.内标对照药的回收率应≥80%。
5. 结语
Caco-2细胞模型具有相对简单、重复性较好、应用范围较广的特点。通过构建致密性良好的Caco-2单层细胞模型，可以分析比较不同药物的Papp值，从而评估药物属于高、中、低渗透性或零渗透性。根据BCS分类，某些高渗透性药物可能被豁免进行生物等效性试验，从而简化新药开发过程。莱恩医药建立了稳定、经验证的Caco-2细胞模型，已助力多个客户完成基于BCS分类系统的生物等效性豁免中的渗透性评价。