1背景介绍
支气管哮喘是由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T 淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等）和细胞组分共同参与的气道慢性炎症性疾病，同时与气道上皮损伤和脱落，气道壁增厚及黏膜水肿引起气道高反应性（Airway hyperresponsiveness，AHR）有关。接触刺激因素可导致气道发生阻塞和气流受限，出现反复发作的喘息、气促、胸闷、咳嗽等症状。目前，治疗哮喘的主要药物有糖皮质激素、抗生素、支气管扩张剂等，用于控制哮喘症状，但仍有部分患者控制效果不佳，且长期服用激素类药物对儿童身体产生一定的不良反应。因此，建立一个能够模拟儿童哮喘的动物模型对于深入理解这种疾病的病理机制以及开发新的治疗策略具有重要意义。豚鼠作为常用的实验动物，因其遗传背景清晰、气道对过敏原的反应与人类相似，常被用于哮喘的研究，而幼龄豚鼠器官和系统的发育尚未成熟，可以很好的模拟儿童哮喘的发作。OVA作为一种常见的过敏原，已被广泛用于诱导各类动物模型产生气道高反应性、气道炎症和气道重塑等哮喘症状。本研究旨在通过腹腔注射OVA后雾化吸入OVA诱导哮喘的方法，在幼龄豚鼠中建立肥胖哮喘模型。在模型建立后，对模型的肺功能和病理改变等主要指标进行检测，并采用阳性药硫酸特布他林片考察模型的适用性，为儿童哮喘治疗药物开发提供合适的模型工具。
2 材料和方法
2.1试验动物
健康Hartley豚鼠36只，SPF级，1~2周龄，体质量105~172g。购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
2.2主要试剂和仪器
（1）主要试剂：OVA；硫酸特布他林片；IgE ELISA试剂盒；戊巴比妥钠
（2）主要仪器：超声雾化器；低速冷冻离心机；酶标分析仪；肺功能检测系统；全自动血液体液分析仪
2.3试验方法
（1）分组：在动物适应性观察结束之后，36只Hartley豚鼠适应性观察1周后，随机分为3组，分别为对照组、模型组、特布他林组。
（2）造模：除对照组外，其他组动物均于第1、3、5天分别腹腔注射OVA溶液（10mg·mL^-1，每只0.5mL）致敏，从第20天起进行OVA雾化激发，采用不同浓度OVA溶液（0、0.165、0.3125、0.625mg·mL^-1）由低到高进行激发，每次激发2min，连续6d。
（3）给药：特布他林组从激发前10 d开始灌胃给药，连续16 d，每天1次，给药体积10mL·kg^-1 ，直至激发结束。对照组及模型组用 0.9%氯化钠溶液代替。
（4）检测指标：①先用2%戊巴比妥钠溶液（2.0 ~ 2.5 mL·kg^-1 ）足趾静脉注射麻醉，采用振荡式肺功能检测系统进行末次激发，测定肺功能指标，包括呼吸系统阻力（Rrs）、呼吸系统弹性（Ers）和组织弹性。②动物腹主动脉采血并处死，开胸前先结扎气管，然后将全肺取出，结扎左侧肺部，用 10%福尔马林溶液固定，用于组织病理学检查。③右侧肺收集肺泡灌洗液（BALF）用于白细胞数（WBC）和嗜酸性粒细胞数 (EO) 测定，并计算嗜酸性粒细胞比率 （EO%）。④采集血浆用于检测IgE含量。⑤取豚鼠完整肺组织，固定，包埋，切片，行HE 染色，显微镜下观察。
3试验结果
3.1 呼吸功能指标的变化
在 0.165 mg·mL^-1 OVA 激发时，与对照组比较，模型组豚鼠 Rrs、Ers 和组织弹性显著升高；在 0.313 mg·mL^-1 OVA 激发时，与对照组比较，模型组豚鼠 Rrs、Ers 和组织弹性水平显著升高；与模型组比较，特布他林组豚鼠Rrs、Ers水平显著降低。在0.625 mg·mL^-1 OVA 激发时，与对照组比较，模型组豚鼠Rrs、Ers和组织弹性水平显著升高；与模型组比较，特布他林组Rrs水平明显降低。详细结果见表1~表3。
表1不同浓度 OVA 激发后对豚鼠Rrs的影响（n=6）

组别	OVA/(mg·mL-1)
	0	0.165	0.313	0.625
对照组	0.2261 ± 0.108 4	-	-	-
模型组	0.1988 ± 0.0466	0.3890 ± 0.4072#	0.4793 ± 0.3103##	0.7866 ± 0.3429#
特布他林组	0.1708 ± 0.0344	0.1949 ± 0.0355*	0.2800 ± 0.1203*	0.4140 ± 0.1974*

注：与对照组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01，与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。
表2不同浓度 OVA 激发后对豚鼠 Ers 的影响（n=6）

组别	OVA/(mg·mL-1)
	0	0.165	0.313	0.625
对照组	2.6640 ± 0.7756	-	-	-
模型组	2.7057 ± 0.5215	5.2575 ± 4.5844#	6.5255 ± 3.0891#	12.4505 ± 2.5977##
特布他林组	2.7227 ± 0.5952	2.9590 ± 0.7840*	4.9183 ± 2.8387	8.2830 ± 5.1144

注：与对照组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01，与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。
表3不同浓度 OVA 激发后对豚鼠组织弹性的影响（n=6）

组别	OVA/(mg·mL-1)
	0	0.165	0.313	0.625
对照组	1.909 3 ± 0.400 2	-	-	-
模型组	1.947 3 ± 0.475 9	2.380 7 ± 0.858 5##	2.413 5 ± 0.784 7##	3.952 6 ± 0.879 3 #
特布他林组	1.972 3 ± 0.464 6	2.034 4 ± 0.620 6**	2.504 6 ± 0.820 8	4.690 6 ± 2.898 4

注：与对照组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01，与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。
3.2 对BALF中白细胞数和嗜酸性细胞数的影响
结果见表4。与对照组相比，模型组豚鼠BALF中嗜酸性粒细胞数及其比率显著升高。与模型组相比，特布他林组嗜酸性粒细胞数稍有降低，但无显著性差异。
表4 过敏性哮喘豚鼠血液中白细胞数和嗜酸性细胞数的水平（n=6）

组别	WBC/[(×109)·L-1]	EO/[(×109)·L-1]	EO比率/%
对照组	0.77 ± 0.27	0.12 ± 0.05	15.71 ± 5.86
模型组	0.72 ± 0.17	0.26 ± 0.11#	35.20 ± 8.40##
特布他林组	0.84 ± 0.41	0.29 ± 0.15	34.76 ± 4.39

注：与对照组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01，与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。
3.3对血清中IgE影响
结果见图1。与对照组比较，模型组豚鼠血清中IgE浓度显著升高。与模型组相比，定喘组低剂量组豚鼠血清中IgE水平显著降低，差异具有统计学意义。
图1过敏性哮喘豚鼠血清中 IgE 的水平 （n=6） 注：1. 对照组；2. 模型组；3. 特布他林组。与对照组比较，^# P＜0.05。
3.4组织病理学检查结果 结果见图2。HE 染色结果显示，对照组动物肺内各级支气管结构正常，肺泡腔无扩张或缩小，腔内及周围未见炎细胞浸润。模型组多个支气管周围可见轻度嗜酸性粒细胞浸润，支气管黏膜壁增高，杯状细胞增生，个别支气管上皮脱落。硫酸特布他林组细支气管周围可见极轻度炎性细胞浸润。
图 2过敏性哮喘豚鼠肺组织的病理变化（HE 染色，×200）
4试验结论与讨论
     肺功能检查是评价气流受限及其可逆性和变异性的重要方法。近年来，应用脉冲震荡方法测定气道阻力在哮喘诊断中应用较多，发作时可出现各类型气道阻力增高。在本研究中采用强制振荡评估豚鼠的气道生理变化，随着OVA浓度升高，豚鼠呼吸系统阻力、呼吸系统弹性和组织弹性增高，表明模型动物具有明显的呼吸功能障碍。哮喘的病理基础是慢性气道炎症，暴露过敏原导致豚鼠呼吸道中的细胞，特别是上皮细胞和炎症细胞募集损伤气道组织。在反复损伤和修复过程中，气道平滑肌、上皮、血管和细胞外基质可发生不可逆的改变，从而导致肺功能降低。组织病理学检查发现，模型动物肺部组织出现嗜酸性粒细胞浸润，杯状细胞增生及支气管黏膜壁增高。IgE 浓度升高和嗜酸性粒细胞增多在过敏性哮喘病理学中起重要作用。当接触变应原时IgE交联使嗜酸性粒细胞和肥大细胞脱颗粒，释放多种炎症介质加重哮喘反应。综上所述，本研究成功构建了一种能够模拟幼儿过敏性哮喘的动物模型，其病理学和生理学特性均满足小儿过敏性哮喘患者的临床表现，针对该模型，阳性药硫酸特布他林治疗效果显著，表明了该模型对药物的反应敏感性，可用于后续儿童过敏性哮喘药物的开发和评估。